Microsatellites development and populational analysis of Physalaemus species of the "cuvieri" group (Anura, Leiperidae)

Muitas espécies de anfíbios estão entre as mais ameaçados de extinção, e no entanto, informações sobre a variabilidade genética e a estruturação genética das suas populações são ainda limitadas. No presente trabalho, a variabilidade genética de populações da espécie Physalaemus cuvieri foi analisada utilizando microssatélites como marcadores moleculares. Considerando-se sua ampla distribuição geográfica, variação morfológica interpopulacional e variação intra- e interpopulacional em algumas características citogenéticas, espécimes de dez populações de P. cuvieri foram amostradas, em São Pedro da Água Branca (MA), Urbana Santo (MA), Porto Nacional (TO), Uberlândia (MG), Vitória Brasil (SP), Palestina (SP), Nova Itapirema (SP), Chapada dos Guimarães (MT), Vitória da Conquista (BA) e Passo Fundo (RS). Dez locos de microssatélites de P. cuvieri foram isolados a partir de uma biblioteca enriquecida em repetições (CA)8 e (GT)8. A amplificação desses locos em 160 indivíduos de P. cuvieri revelou uma média de 5,7 alelos por loco e uma heterozigosidade esperada variando de 0,30 a 0,85. Embora a maior parte da variação genética esteja dentro das populações, o valor global do FST encontrado indica uma alta diferenciação entre essas populações. O baixo fluxo gênico encontrado sugere baixa capacidade dispersiva, no padrão de escala geográfica usado neste trabalho, e condiz com o comportamento filopátrico atribuído aos anuros. Nesse estudo foi ainda verificado que não existe correlação entre distância geográfica e distância genética das populações amostradas, sugerindo uma alta fidelidade dessa espécie aos seus locais de desova. Os resultados indicam que a distância geográfica sozinha não explica a variabilidade genética dessas populações. Duas populações, São Pedro da Água Branca (MA) e Nova Itapirema (SP), possivelmente passaram por efeito de gargalo populacional (bottleneck), que pode ser resultado, entre outros fatores, da destruição de habitat levando à fragmentação da população. Dos dez locos de microssatélites desenvolvidos para P. cuvieri, nove foram utilizados para verificar a possibilidade de amplificação e sua aplicabilidade no estudo da estrutura genética de duas outras espécies do grupo cuvieri muito proximamente relacionadas à P. cuvieri. Essas espécies são: P. ephippifer (15 indivíduos) e P. albonotatus (11). As duas populações estudadas ficaram isoladas das cinco de P. cuvieri, mostrando um alto grau de diferenciação genética, e indicando claramente sua condição de espécie distinta de P. cuvieri. A população de Crateús - CE agrupou com Urbano Santos - MA (ambas P. cuvieri). Este resultado corrobora os resultados de estudos citogenéticos. As populações de Porto Nacional (TO) e Passo Fundo (RS) formaram dois grupos de indivíduos cada uma. Parte dos indivíduos de Porto Nacional agrupou com a população de Uberlândia (MG) de P. cuvieri, e o restante dos indivíduos não mostrou nenhum agrupamento com qualquer outra população e espécies analisadas neste trabalho. Resultados semelhantes foram obtidos com a população de Passo Fundo, que não mostrou agrupamento com nenhuma outra população analisada. Estudos adicionais dessas populações serão necessários para melhor compreender esses dados. O conhecimento do padrão de dispersão da variabilidade genética de P. cuvieri, avaliada por microssatélites, somado ao conhecimento acumulado, obtido por meio de outras metodologias, poderá contribuir para a definição de estratégias de conservação e contribuir para o delineamento entre as fronteiras taxonômicas dessa espécieEven though many amphibian species are among the most endangered animals, the knowledge about their genetic variability and population genetic structure is still limited. In the present work, natural populations of the barker frog Physalaemus cuvieri were analyzed for genetic variability and differentiation using microsatellites, considering its wide geographic distribution, interpopulational morphological variation and cytogenetic intra- and interpopulational variation. Analyzes comprised specimens from ten P. cuvieri populations sampled in the following regions of Brazil: São Pedro da Água Branca (MA), Urbano Santo (MA), Porto Nacional (TO), Uberlândia (MG), Vitória Brasil (SP), Palestina (SP), Nova Itapirema (SP), Chapada dos Guimarães (MT), Vitória da Conquista (BA) and Passo Fundo (RS). Ten microsatellite loci were isolated for P. cuvieri from a library enriched in (CA)8 and (GT)8 repeats. In 160 P. cuvieri individuals, the average number of alleles per locus was 5.7 and the expected heterozygosity ranged from 0.30 to 0.85. Although most of the genetic variation was found within populations, the overall FST value indicated high genetic differentiation among the populations. The low gene flow among populations suggested low dispersion capability within the geographic scale pattern used in this work, which is compatible with the anuran philopatric behavior. In addition, there was no correlation between geographic and genetic distances of these populations, suggesting fidelity of P. cuvieri populations to their spawning place. These results indicated that the geographic distance alone does not explain the genetic variability observed among these populations. The data also indicated that the populations from São Pedro da Água Branca (MA) and Nova Itapirema (SP), respectively in the Northeast and Southeast regions of Brazil, have likely gone through a recent population bottleneck effect. Destruction of natural habitats leading to population fragmentation could be a major cause of this suggested bottleneck effect. Of the ten microsatellite loci developed for P. cuvieri, nine were used to investigate cross-amplification and suitability for population genetic structure studies in two other species of the cuvieri group closely related to P. cuvieri. These species are: P. ephippifer (15 specimens) and P. albonotatus (11 specimens). These two populations remained isolated from all populations of P. cuvieri, demonstrating its high genetic differentiation, pointing that these two species are distinct from P. cuvieri. The Crateús (CE) population was grouped with Urbano Santos (MA) population (both P. cuvieri). This result corroborated previous cytogenetic results. The Porto Nacional (TO) and Passo Fundo (RS) populations were divided in two sets of individuals each one. Part of Porto Nacional individuals were clustering with P. cuvieri from Uberlândia (MG), and the remaining did not show any grouping with none of other analyzed species. Similar results were found to Passo Fundo population, which also did not show any group with the analyzed species. The knowledge of the dispersion pattern of the P. cuvieri genetic variability evaluated by microsatellites, in addition to the genetic variability data obtained using other methodologies, will contribute for the development of future ecological and conservation strategies and to improve the taxonomy of this species